شستشوی ستون HPLC 

همه ما می دانیم که ستون های HPLC طول عمر محدودی دارند و حتی پس از تمیز کردن و ذخیره سازی خوب به پایان عمر خود می رسند. با این حال، اقدامات خاصی وجود دارد که می توانید برای به دست آوردن حداکثر طول عمر ستون خود دنبال کنید. شستشوی ستون HPLC در طبیب شیمی صورت می گیرد.

تمیز کردن ستون HPLC

پس از استفاده از ستون، همیشه توصیه می شود ستون را قبل از باز کردن از سیستم تمیز کنید. روش تمیز کردن معمولاً شامل استفاده از شستشوی ایزوکراتیک-گرادیان است که به آخرین سیستم حلال روی ستون نزدیک‌تر است. اما بافر را با آب درجه HPLC جایگزین می‌ کند. این اطمینان حاصل می کند که اجزای بافر از ستون حذف می شوند. سپس می‌ توانید درصد حلال آلی را در شستشو افزایش دهید تا ناخالصی‌های آبگریز را بیشتر از بین ببرید.

فلاشینگ معکوس ستون HPLC

اگر متوجه شدید که بدتر شدن شکل پیک همراه با افزایش فشار برگشتی وجود دارد، توصیه می شود ستون را معکوس کنید. قبل از شستشوی معکوس، مهم است که مطمئن شوید فاز متحرک یا حلال درون ستونی شما با حلال های تمیزکننده شما قابل اختلاط است و میزان جریان شما بیش از نصف دبی توصیه شده معمولی برای ستون نباشد. می توانید حجم ستون خود را با استفاده از معادله زیر تعیین کنید: V = 3.14* r²L که V حجم ستون بر حسب میلی لیتر، r شعاع ستون بر حسب سانتی متر و L طول ستون بر حسب سانتی متر است.

وقتی نوبت به تمیز کردن مناسب ستون HPLC فاز معکوس پس از استفاده می رسد. ابتدا فاز متحرک خود را به 95% آب گرید HPLC و 5% استونیتریل تغییر دهید. سپس با حدود 10 حجم ستون از آن را با نصف سرعت جریان از طریق ستون HPLC بشویید. با این کار هر بافری که در ستون HPLC باقی مانده است حذف می شود. سپس می توانید گام به گام در صورت نیاز حرکت کنید تا حلال آلی را به حدود 95٪ استونیتریل و 5٪ آب افزایش دهید.

پس از فلاشینگ معکوس، قبل از استفاده، ستون را در جهت و حالت رو به جلو با فاز متحرک معمولی وصل کنید. توجه داشته باشید که هنگام شستشوی معکوس ستون، ستون را از آشکارساز جدا کنید.

ذخیره سازی ستون اچ پی ال سی

همچنین مهم است که ستون را به درستی پس از استفاده ذخیره کنید، به خصوص اینکه برای مدت طولانی باقی خواهد ماند. بسیار مهم است که ستون HPLC خود را در حالیکه هنوز حاوی بافر یا عوامل جفت یونی است ذخیره نکنید. برای اطمینان از این امر، پنج حجم ستونی از فاز متحرک خود را بدون بافر از طریق ستون HPLC بشویید.

برای ستون هایی که دارای معرف های جفت یونی هستند، ممکن است برای حذف کامل آنها از ستون، شستشوی طولانی مدت لازم باشد. پس از شستشو، ستون های فاز معکوس را در استونیتریل/آب (65:35 v/v) ذخیره کنید، می توان از متانول به جای استونیتریل، ستون های فاز معمولی در 100% هگزان یا IPA، ستون های تبادل یونی در متانول 100% و ستون های HILIC در استونیتریل/آب (80:20 v/v)

بهترین روش شستن ستون HPLC ریورس فاز

1) اول حذف بافر (خیلی مهم)اگر بافر (مثل فسفات، استات) استفاده کردی

•  با آب دیونیزه (Milli-Q) بشور 
• حدود 10–20 حجم ستون (Column Volume)
•  هدف: حذف کامل نمک‌ها – اگر این مرحله حذف بشه → رسوب و خراب شدن ستون

2) انتقال تدریجی به حلال آلی

• بعد از آب: 50% آب + 50% ACN یا متانول
•  بعد 100% ACN یا متانول
•  حدود 10–20 CV هر مرحله

3) شست‌وشوی قوی (Strong Wash)

برای چربی‌ها و مواد چسبیده :

 100% Acetonitrile (ACN)یا 100% Methanol 20–30 دقیقه یا 10–20 CV

4) اگر آلودگی شدید بود (Dirty Column)

این مرحله فقط در صورت نیاز:

 ایزوپروپانول (IPA) 100%

 یا مخلوط:50% ACN + 50% IPA برای حذف مواد خیلی هیدروفوب

5) برگشت به شرایط کاریبعد از شست‌وشو:

• برگرد به موبایل فاز اولیه (مثلاً 70:30 آب/ACN)
•  چند دقیقه Equilibrate کن

 نکات خیلی مهم هیچ‌وقت :بافر را مستقیم با ACN قاطی نکنستون را خشک نگذار

pH خیلی بالا یا پایین (معمولاً 2–8 ایمن)

همیشه:از فیلتر 0.22 یا 0.45 µm استفاده کن

Guard Column داشته باشبعد از کار ستون را در 100% ACN نگه دار