کروماتوگرافی چیست؟ از اصول اولیه تا پیشرفته‌ترین تکنیک‌های جداسازی

اگر تا حالا در یک آزمایشگاه شیمی، داروسازی یا صنایع غذایی قدم گذاشته باشید، حتماً نام کروماتوگرافی به گوشتان خورده است. شاید برایتان سؤال شده باشد که کروماتوگرافی چیست و چرا اینقدر در آنالیز مواد مهم است؟ راستش را بخواهید، کروماتوگرافی یکی از قدرتمندترین و پرکاربردترین تکنیک‌های جداسازی در دنیای علم است که بدون آن، بسیاری از پیشرفت‌های امروزی در داروسازی، پزشکی قانونی، محیط زیست و حتی صنعت غذا ممکن نبود.

در این مقاله از مجله طبیب شیمی (مرجع تخصصی تأمین مواد شیمیایی صنعتی و تجهیزات آزمایشگاهی)، قصد داریم همه چیز را درباره کروماتوگرافی بررسی کنیم. از تعریف ساده و اصول اولیه تا معرفی انواع مختلف آن مانندHPLC، GC و TLC، همچنین تجهیزات مورد نیاز و کاربردهای هر کدام. اگر دانشجو، پژوهشگر، تکنسین آزمایشگاه یا علاقه‌مند به علوم شیمی و تجزیه هستید، این مقاله را از دست ندهید.

تمام اطلاعات این مقاله بر اساس منابع علمی معتبر و تجربه کارشناسان طبیب شیمی در تأمین تجهیزات و مواد شیمیایی آزمایشگاهی تنظیم شده است.

کروماتوگرافی چیست؟ هر آنچه باید درباره علم جداسازی بدانید

کروماتوگرافی (Chromatography) یک روش فیزیکی-شیمیایی برای جداسازی، شناسایی و خالص‌سازی ترکیبات موجود در یک مخلوط است. این تکنیک بر اساس توزیع متفاوت اجزای یک نمونه بین دو فاز کار می‌کند:

• فاز ساکن (Stationary Phase) : یک ماده جامد یا مایع که روی یک بستر ثابت قرار دارد.
• فاز متحرک (Mobile Phase) : یک گاز یا مایع که از روی فاز ساکن عبور می‌کند و نمونه را با خود حمل می‌کند.

اصل ساده کروماتوگرافی – داستان یک مسابقه

تصور کنید یک گروه دونده در یک مسیر شنی قرار دارند. بعضی از دوندگان با سطح شنی تعامل بیشتری دارند و آهسته‌تر حرکت می‌کنند. بعضی دیگر تعامل کمتری دارند و سریع‌تر به خط پایان می‌رسند. در کروماتوگرافی هم دقیقاً همین اتفاق می‌افتد:

• ترکیباتی که با فاز ساکن برهمکنش قوی‌تری دارند – دیرتر از ستون خارج می‌شوند.
• ترکیباتی که با فاز ساکن برهمکنش ضعیف‌تری دارند– زودتر از ستون خارج می‌شوند.

نتیجه: اجزای مخلوط در زمان‌های مختلف از سیستم خارج می‌شوند و یک کروماتوگرام (Chromatogram) – نموداری شامل چندین پیک – ثبت می‌شود. هر پیک نمایانگر یک ترکیب خاص است.

💡 نکته جالب: نام کروماتوگرافی از دو کلمه یونانی chroma (رنگ) و graphein (نوشتن) گرفته شده است. میخائیل تسوت، دانشمند روسی، در سال ۱۹۰۰ از این روش برای جداسازی رنگدانه‌های سبز گیاهی استفاده کرد و نام آن را کروماتوگرافی گذاشت .

اصول اولیه کروماتوگرافی – چهار پارامتر کلیدی

برای درک بهتر اینکه کروماتوگرافی چیست و چگونه کار می‌کند، باید با چند پارامتر اساسی آشنا شوید.

 زمان بازداری (Retention Time – tR)

زمانی که طول می‌کشد تا یک ترکیب از زمان تزریق تا لحظه خروج از ستون (دتکتور) طی شود. هر ترکیب در شرایط ثابت، زمان بازداری مشخصی دارد که برای شناسایی کیفی استفاده می‌شود.

 فاکتور بازداری (Retention Factor – k)

نسبت مدت زمانی که یک ترکیب در فاز ساکن صرف می‌کند به مدت زمانی که در فاز متحرک صرف می‌کند. فرمول: k = (tR – t0) / t0 که در آن t0 زمان بازداری ترکیب غیربازداری‌شونده (dead time) است.

راندمان ستون (Efficiency – N)

تعداد صفحات تئوری (Theoretical Plates) – معیاری برای ارزیابی کارایی ستون کروماتوگرافی. هرچه تعداد صفحات تئوری بیشتر باشد، ستون راندمان بالاتری دارد و پیک‌ها باریک‌تر و جدا شده‌تر هستند.

گزینش‌پذیری (Selectivity – α)

نسبت فاکتورهای بازداری دو ترکیب مجاور. هرچه α به ۱ نزدیک‌تر باشد، جداسازی دشوارتر است. گزینش‌پذیری به ماهیت فاز ساکن، فاز متحرک و دما بستگی دارد.

انواع کروماتوگرافی – دسته‌بندی بر اساس روش و مکانیسم

کروماتوگرافی انواع مختلفی دارد که بر اساس معیارهای گوناگون دسته‌بندی می‌شوند.

شکل فاز ساکن

1. کروماتوگرافی ستونی (Column) | فاز ساکن درون یک ستون لوله‌ای قرار دارد | HPLC، GC
2. کروماتوگرافی صفحه‌ای (Planar) | فاز ساکن روی یک صفحه صاف قرار دارد |کروماتوگرافی کاغذی 

بر اساس فاز متحرک

1. 1. 1. کروماتوگرافی مایع (LC) | مایع (حلال) | ترکیبات قطبی تا ناقطبی، حساس به حرارت
      2. کروماتوگرافی گازی (GC) | گاز (هلیم، نیتروژن، هیدروژن) | ترکیبات فرار و پایدار در حرارت
      3. کروماتوگرافی سیال فوق‌بحرانی (SFC) | CO₂ فوق‌بحرانی | ترکیبات نیمه فرار

دسته‌بندی بر اساس مکانیسم جداسازی

1. تقسیم (Partition) | اختلاف حلالیت بین دو فاز مایع | کروماتوگرافی مایع-مایع
2. جذب (Adsorption) | اختلاف جذب روی سطح جامد | TLC، کروماتوگرافی سیلیکاژل
3. تبادل یونی (Ion Exchange) | اختلاف بار الکتریکی | جداسازی پروتئین‌ها، اسیدهای آمینه
4. اندازه (Size Exclusion) | اختلاف اندازه مولکولی | جداسازی پلیمرها، پروتئین‌های بزرگ
5. تمایل (Affinity) | برهمکنش اختصاصی لیگاند-هدف | جداسازی آنتی‌بادی‌ها، آنزیم‌ها

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) – پیشرفته‌ترین روش

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) یکی از پرکاربردترین و دقیق‌ترین روش‌های کروماتوگرافی است که در صنایع دارویی، غذایی، محیط زیست و آرایشی-بهداشتی استفاده می‌شود.

 اجزای اصلی دستگاه HPLC

انواع HPLC بر اساس قطبیت فازها

کاربردهای HPLC

• کنترل کیفیت مواد اولیه و محصولات نهایی در صنایع داروسازی
•  آنالیز مواد غذایی (کافئین، ویتامین‌ها، نگهدارنده‌ها، آفت‌کش‌ها)
• آزمایش‌های زیست‌شناسی و بیوشیمی (پروتئین‌ها، پپتیدها، اسیدهای نوکلئیک)
• آنالیز محیطی (آلاینده‌ها، آفت‌کش‌ها در آب و خاک)
•  پزشکی قانونی (تشخیص مواد مخدر، سموم و داروها)

کروماتوگرافی گازی (GC) – تخصصی برای ترکیبات فرار

کروماتوگرافی گازی (Gas Chromatography) روشی است که در آن فاز متحرک گاز است (معمولاً هلیم، نیتروژن یا هیدروژن) و فاز ساکن یک مایع با نقطه جوش بالا (پوشش داده شده روی ذرات جامد) یا یک جامد است.

تفاوت کلیدی GC با HPLC

کاربردهای اصلی GC

• آنالیز مواد نفتی و پتروشیمی (بنزین، حلال‌ها، ترکیبات آروماتیک)
• تشخیص الکل‌ها و ترکیبات فرار در نوشیدنی‌ها و مواد غذایی
• آنالیز آفت‌کش‌ها و آلاینده‌های محیطی
• پزشکی قانونی (آزمایش الکل خون، مواد مخدر)
• صنایع عطر و طعم‌دهنده‌ها

⚠️ محدودیت GC: ترکیبات غیرفرار، قطبی قوی (مثل نمک‌ها) و حساس به حرارت (مثل پروتئین‌ها) را نمی‌توان با GC آنالیز کرد – حداقل بدون مشتق‌سازی (Derivatization).

کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) – ساده، سریع و اقتصادی

TLC (Thin Layer Chromatography) یکی از ساده‌ترین و ارزان‌ترین روش‌های کروماتوگرافی است که برای آنالیزهای کیفی و نیمه‌کمی استفاده می‌شود.

اصول TLC

• فاز ساکن: یک لایه نازک از سیلیکاژل یا آلومینا روی یک صفحه شیشه‌ای، آلومینیومی یا پلاستیکی.
• فاز متحرک: یک حلال یا مخلوط حلال‌ها (الوینت – Eluent).
• روش کار: نمونه (لکه‌های کوچک) روی صفحه چکانده می‌شود، صفحه در یک محفظه دربسته حاوی فاز متحرک قرار می‌گیرد، حلال به سمت بالا حرکت می‌کند و ترکیبات را بر اساس میزان تعامل با فاز ساکن جدا می‌کند.

محاسبه Rf در TLC

فاکتور بازداری (Retention Factor – Rf) = مسافت حرکت ترکیب ÷ مسافت حرکت فاز متحرک (خط حلال)

•  Rf بین ۰ و ۱ است.
•  Rf پایین (۰.۱-۰.۳) یعنی ترکیب با فاز ساکن برهمکنش قوی دارد.
•  Rf بالا (۰.۷-۰.۹) یعنی ترکیب با فاز ساکن برهمکنش ضعیف دارد.

کاربردهای TLC

1. پایش پیشرفت واکنش‌های شیمیایی (در حین واکنش، لکه محصول در حال افزایش است)
2. شناسایی ترکیبات در عصاره‌های گیاهی و اسانس‌ها
3. ارزیابی خلوص یک ترکیب (تعداد لکه‌ها نشان‌دهنده تعداد ترکیبات است)
4. روش سریع و ارزان قبل از آنالیز با HPLC

کروماتوگرافی تبادل یونی (IEC) – مخصوص مولکول‌های باردار

IEC (Ion Exchange Chromatography) روشی است که بر اساس اختلاف بار الکتریکی ترکیبات کار می‌کند. این روش به خصوص برای جداسازی پروتئین‌ها، اسیدهای آمینه، پپتیدها و اسیدهای نوکلئیک بسیار محبوب است.

انواع تبادل یونی

1. تبادل کاتیونی (Cation Exchange) | منفی | کاتیون‌ها (یون‌های با بار مثبت) |
2. تبادل آنیونی (Anion Exchange) | مثبت | آنیون‌ها (یون‌های با بار منفی) |

کاربردهای اصلی IEC

• خالص‌سازی پروتئین‌ها و آنزیم‌ها در بیوتکنولوژی
• جداسازی اسیدهای آمینه و اسیدهای نوکلئیک
• آنالیز یون‌های معدنی در آب و محیط زیست
• صنایع لبنی (جداسازی پروتئین‌های شیر)

کروماتوگرافی اندازه (SEC/GPC) – تفکیک بر اساس اندازه مولکولی

SEC (Size Exclusion Chromatography) که با نام GPC (Gel Permeation Chromatography) نیز شناخته می‌شود، ترکیبات را بر اساس اندازه هیدرودینامیکی (حجم مولکولی) جدا می‌کند، نه بر اساس برهمکنش شیمیایی.

چگونه کار می‌کند؟

• ستون حاوی ذرات متخلخل (پلیمر یا سیلیکا با حفره‌های کنترل‌شده) است.
• مولکول‌های بزرگ نمی‌توانند وارد حفره‌ها شوند → زودتر از ستون خارج می‌شوند.
• مولکول‌های کوچک وارد حفره‌ها شده و مسیر طولانی‌تری طی می‌کنند → دیرتر خارج می‌شوند.

⚠️ نکته مهم: در SEC برعکس اکثر کروماتوگرافی‌ها، بزرگترین مولکول‌ها اول و کوچکترین‌ها آخر خارج می‌شوند.

کاربردهای SEC

• تعیین توزیع وزن مولکولی پلیمرها (پلی‌استایرن، پلی‌اتیلن، پلی‌اورتان)
• آنالیز پروتئین‌ها و بررسی تجمع (aggregation) آنها
• جداسازی ترکیبات با وزن مولکولی مختلف در صنایع غذایی و دارویی

تجهیزات و مواد مصرفی مورد نیاز در کروماتوگرافی

برای راه‌اندازی و نگهداری یک سیستم کروماتوگرافی (به خصوص HPLC) به تجهیزات زیر نیاز دارید:

مواد شیمیایی و حلال‌ها

• حلال‌های با خلوص بالا (HPLC Grade): متانول، استونیتریل، آب دیونیزه، هگزان، ایزوپروپانول، اتانول
• بافرها و نمک‌ها: فسفات، استات، تری‌فلورواستیک اسید (TFA)، فرمیک اسید
• مواد استاندارد (Reference Standards): برای کالیبراسیون و شناسایی پیک‌ها

قطعات ستون و مصرفی

• ستون کروماتوگرافی : با فاز ساکن مناسب (C18، C8، سیلیکاژل، آمید، و غیره)
• پیش‌ستون (Guard Column) : محافظت از ستون اصلی در برابر آلودگی‌ها و ذرات
• فیلترهای درون خطی (In-line Filters) : جلوگیری از ورود ذرات به پمپ و ستون
• ویال و درپوش (Vials & Caps) : برای نگهداری نمونه‌ها و استانداردها

قطعات یدکی حیاتی

1. Rotor Seal | آب‌بندی شیر تزریق | 7750-040، 0100-1853 |
2. سیل پیستون (Piston Seal) | آب‌بندی پمپ | 5063-6589 |
3. پیستون (Plunger/Piston) | ایجاد فشار | بسته به مدل پمپ |
4. Stator | سطح ثابت شیر تزریق | 0101-0625 |
5. Needle Seat | آب‌بندی سوزن تزریق | G1313-60010 |

📌 نکته: طبیب شیمی کلیه تجهیزات و قطعات یدکی مورد نیاز برای کروماتوگرافی (HPLC، GC، TLC) را با کیفیت تضمینی و قیمت رقابتی تأمین می‌کند.

کاربردهای صنعتی کروماتوگرافی – چرا این تکنیک اینقدر مهم است؟

کروماتوگرافی چیست بدون اشاره به کاربردهای گسترده آن در صنعت ناقص است. این تکنیک در حوزه‌های زیر نقشی حیاتی دارد:

صنعت داروسازی (Pharmaceutical)

1. 1. • کنترل کیفیت مواد اولیه دارویی (API)
      • آنالیز محصولات نهایی برای تأیید خلوص و مقدار ماده مؤثره
      • مطالعات پایداری (Stability Studies) داروها
      •  آنالیز ناخالصی‌ها (Impurity Profiling) – مطابق با استانداردهای USP و EP

 غذا و آشامیدنی (Food & Beverage)

1. 1. • تعیین میزان کافئین در قهوه، چای و نوشابه‌ها
      • آنالیز ویتامین‌ها و مواد افزودنی (نگهدارنده‌ها، آنتی‌اکسیدان‌ها، شیرین‌کننده‌ها)
      • تشخیص باقیمانده آفت‌کش‌ها و سموم قارچی (Mycotoxins)
      •  کنترل کیفیت روغن‌ها و چربی‌ها

صنعت نفت و پتروشیمی (Petrochemical)

1. 1. • آنالیز ترکیبات بنزین و سوخت
      • تعیین توزیع کربن در هیدروکربن‌ها (Simulated Distillation)
      • آنالیز گازها و ترکیبات فرار با GC

محیط زیست (Environmental)

1. 1. • آنالیز آلاینده‌های آب و خاک (آفت‌کش‌ها، PCBs، PAHs)
      • پایش آلودگی هوا (ترکیبات آلی فرار – VOCs)
      • آنالیز فلزات سنگین با ترکیب HPLC با ICP-MS

پزشکی قانونی و علوم آزمایشگاهی (Forensics & Clinical)

1. 1. • تشخیص مواد مخدر و متابولیت‌ها در خون و ادرار
      • آنالیز سموم (Toxicology Screening)
      • آزمایش الکل خون

 راهنمای انتخاب روش کروماتوگرافی مناسب

اگر بین روش‌های مختلف کروماتوگرافی مردد هستید، جدول زیر به شما کمک می‌کند:

جمع‌بندی و دعوت به اقدام (CTA)

حالا دیگر می‌دانید کروماتوگرافی چیست و چرا این علم در صنایع مختلف از داروسازی تا محیط زیست اینقدر حیاتی است. از HPLC و GC تا TLC و IEC – هر روش مزایا و کاربردهای خاص خود را دارد و انتخاب روش مناسب بستگی به ماهیت نمونه، دقت مورد نیاز و بودجه شما دارد.

اگر در زمینه راه‌اندازی یک آزمایشگاه کروماتوگرافی، تأمین تجهیزات، قطعات یدکی یا مواد شیمیایی با خلوص بالا فعالیت دارید، طبیب شیمی همراه شماست.

محصولات و خدمات ما:

1. 1. • تجهیزات HPLC و GC (برندهای معتبر جهانی)
      • ستون‌های کروماتوگرافی (C18، C8، سیلیکاژل، آمید، کایرال، SEC)
      • حلال‌های HPLC Grade (متانول، استونیتریل، هگزان، ایزوپروپانول)
      • قطعات یدکی (Rotor Seal، Piston Seal، Stator، Needle Seat، پیستون پمپ)
      • مشاوره فنی برای انتخاب روش و تجهیزات مناسب با نیاز شما

سوالات پرتکرار درباره کروماتوگرافی (FAQ)

کروماتوگرافی چیست به زبان ساده؟

کروماتوگرافی یک روش جداسازی است که در آن اجزای یک مخلوط بر اساس «میزان چسبیدن» به یک سطح (فاز ساکن) از هم جدا می‌شوند. آنهایی که کمتر می‌چسبند زودتر حرکت می‌کنند.

تفاوت کروماتوگرافی HPLC و GC چیست؟

در HPLC فاز متحرک مایع و تحت فشار بالاست و برای ترکیبات غیرفرار و حساس به حرارت مناسب است. در GC فاز متحرک گاز است، دما بالا می‌رود و فقط ترکیبات فرار و پایدار در حرارت قابل آنالیز هستند.

کروماتوگرام چه اطلاعاتی به ما می‌دهد؟

1. 1. • زمان بازداری (tR): شناسایی کیفی ترکیب (با مقایسه با استاندارد)
      • مساحت زیر پیک (Area): تعیین مقدار (غلظت) ترکیب (با استفاده از منحنی کالیبراسیون)
      • ارتفاع و عرض پیک: ارزیابی راندمان ستون و کیفیت جداسازی

 رایج‌ترین دتکتور در HPLC چیست؟

دتکتور UV-Vis (یا DAD – Diode Array Detector) رایج‌ترین گزینه است. ترکیباتی که نور فرابنفش یا مرئی را جذب می‌کنند (معمولاً با حلقه آروماتیک یا پیوند دوگانه مزدوج) قابل شناسایی هستند.

آیا می‌توانم با یک ستون C18 تمام ترکیبات را آنالیز کنم؟

خیر. ستون C18 (فاز معکوس) برای حدود ۸۰٪ کاربردهای HPLC مناسب است، اما برای ترکیبات بسیار قطبی (بدون جذب UV)، یون‌ها یا انانتیومرها، به ستون‌های تخصصی (مانند HILIC، IEC یا فاز کایرال) نیاز دارید.

قیمت یک دستگاه HPLC چقدر است؟

قیمت دستگاه‌های HPLC بسته به برند (آژیلنت، واترس، شیمادزو، لوکسون)، تعداد دتکتورها و آپشن‌ها از حدود ۸۰۰ میلیون تومان تا بیش از ۵ میلیارد تومان متغیر است. دستگاه‌های دست دوم و بازسازی‌شده گزینه اقتصادی‌تری هستند.