کروماتوگرافی کاغذی

شومبین در سال ۱۸۶۰ با عبور مایعات از میان کاغذ مخصوص متوجه شد که حلال خالص در شیارهای کاغذ سریع‌تر از محلول‌ها حرکت می‌کند. او دریافت که برخی از اجسام تشکیل‌دهنده محلول‌ها نسبت به برخی دیگر سریع‌تر حرکت می‌کنند. روشی برای جداسازی رنگدانه‌های گیاهی، آلکالوئیدها، چربی‌ها، روغن‌ها و عصاره‌های مواد غذایی ابداع نمود. در این روش، اساس تفکیک مبتنی بر جذب مواد موجود در محلول بر روی کاغذ در جریان عبور از شیارهای آن است. با اندازه‌گیری فاصله جبهه حلال (حلالی که مواد قبلاً در آن حل شده‌اند) و فاصله اجسام جذبی از مبدا حرکت، نوع ماده مجهول قابل تعیین است. بدیهی است که این روش با روش کروماتوگرافی کاغذی که امروز متداول است (گسترش کروماتوگرام به وسیله یک حلال) اختلاف اساسی دارد، زیرا در روش شومبین، حلالی به عنوان گسترش‌دهنده به کار نمی‌رود.

شیوه کروماتوگرافی کاغذی chromatography

این شیوه از جداسازی تا سال ۱۹۴۳ پیشرفت چشمگیری نکرد تا اینکه در سال‌های بعد از ۱۹۴۳، مارتن و همکاران وی با الهام از روش شومبین و تلفیق آن با روش استخراج با جریان مخالف، شیوه‌ای به نام کروماتوگرافی کاغذی ابداع کردند. این محققان نشان دادند که اگر قطره کوچکی از ماده آزمایشی را بر روی کاغذ صافی ویژه‌ای قرار دهند و آن را با حلال مناسب گسترش دهند، هر یک از تشکیل‌دهنده‌های نمونه آزمایشی در فاصله معینی از مبدا حرکت بر روی کاغذ قرار می‌گیرد. اگرچه خاصیت جذب سطحی و مبادله یون در تمام کاغذهای مورد استفاده در کروماتوگرافی کاغذی، کم و بیش وجود دارد، با این حال مهاجرت افتراقی اجسام به هنگام گسترش کروماتوگرام از اختلاف ضریب تقسیم آن‌ها بین دو فاز ثابت و متحرک مایع سرچشمه می‌گیرد. لازم به یادآوری است که گاهی از کاغذهای ویژه‌ای که به آن‌ها آلومینا تزریق می‌شود یا از مبادله‌کننده‌های یون پوشیده می‌شوند. برای جریان کروماتوگرافی کاغذی تحت حاکمیت پدیده جذب سطحی یا مبادله‌ای استفاده می‌گردد.

اساس تجزیه کیفی با کروماتوگرافی کاغذی، همانند روش شومبین، بر پایه اندازه‌گیری جبهه حلال و فاصله جسم در روی کاغذ از مبدا حرکت و تعیین نسبت این دو (Rf) استوار است.

تجزیه کمی به کمک کروماتوگرافی کاغذی بسیار ظریف است و این عمل را می‌توان با اندازه‌گیری مساحت لکه حاصل در روی کروماتوگرام و با استفاده از منحنی معیارگیری انجام داد. همچنین، می‌توان لکه ایجاد شده را با شستشو از کاغذ خارج و به کمک روش‌های حساس، نظیر تجزیه به روش فعال‌سازی، اندازه‌گیری کرد.

اصول نظری

نظر به اینکه مقدار R_f در شرایط استاندارد برای هر جسم مقدار ثابتی است، از این رو می‌توان با اندازه گیری R_f یک جسم مجهول، نسبت به تشخیص تقریبی و مقدماتی آن اقدام کرد. همچنین با اندازه گیری R_f اجسام مختلف به طور جداگانه و یا در کنار هم در شرایط یکسان می‌توان امکان شناسایی برخی از آنها را در حضور برخی دیگر پیش‌بینی کرد. برای تشخیص اجسام تشکیل دهنده یک مخلوط لازم است پیشاپیش اطلاع کلی و عمومی از تشکیل دهنده های آن را در دست داشت و آنگاه به کروماتوگرافی آن در کنار نمونه های خالص از تشکیل دهنده های مخلوط (به عنوان شاهد ) اقدام کرد. لازم به ذکر است که ترکیبات مختلف اغلب دارای R_f نزدیک به هم بوده و این امر مسئله تشخیص دهنده های یک نمونه مجهول را مشکل و پیچیده می سازد .می توان نتیجه گرفت که R_f یک کمیت نسبی و مقایسه‌ای است و به دلیل تغییر آن با شرایط تجربی، کاربرد مطلق آن از اهمیت کمتری برخوردار بوده و در برخی موارد فاقد ارزش عملی است.

عوامل وابسته به نمونه آزمایشی

اجسام مختلف موجود در یک نمونه آزمایشی بر مقدار Rf یکدیگر تأثیر می‌گذارند. به بیان دیگر، مقدار Rf به‌دست‌آمده در کروماتوگرافی انفرادی هر یک از تشکیل‌دهنده‌های فاز، با Rf آن‌ها در حضور یکدیگر متفاوت است. این امر به تأثیر متقابل و گاهی تأثیر شیمیایی تشکیل‌دهنده‌های مخلوط آزمایشی بر یکدیگر مرتبط می‌شود. حتی در برخی موارد، وجود چند جسم در محلول آزمایشی منجر به تشکیل ترکیبی تازه با Rf جدید می‌شود. به‌عنوان مثال، وجود الکل در نمونه‌ای از اسید آمینه باعث ایجاد استر با Rf کاملاً متفاوت می‌گردد. از سوی دیگر، غلظت اجسام در نمونه آزمایشی بر روی ضریب تقسیم آن‌ها مؤثر بوده و از این راه بر Rf نیز تأثیر می‌گذارد.

اصول عملی

چهار مطلب مهم موضوع بحث این قسمت را تشکیل می‌دهند که در زیر به توضیح و بررسی مختصر هریک از آنها می پردازیم:

انتخاب فاز متحرک

یک فاز متحرک مناسب برای کروماتوگرافی کاغذی باید مطیع نتایج زیر را به دست دهد.

• مقدار R_f برای هر یک از تشکیل دهنده های نمونه های آزمایشی بین 0.05 و 0.85 قرار می‌گیرد.
• اختلاف بین مقادیر R_f دو جسم مورد جداسازی باید حداقل 0.05 باشد.
• ضریب تقسیم اجسام تشکیل دهنده مخلوط بین فاز ثابت و متحرک باید مستقل از غلظت آنها باشد (ایزوترم خطی) تا یک لکه کروی کروماتوگرام حاصل شود.
• حلال نباید با هیچ یک از تشکیل دهنده های مخلوط آزمایشی به طور شیمیایی وارد عمل شود.
• حلال به هنگام آشکارسازی کروماتوگرام ایجاد مزاحمت نکنم (مزاح آشکارسازی نگردد).
• نسبت ترکیبی حلال نباید در جریان آزمایشی تغییر کند .

بررسی نمونه‌های متنوع و کاملا متفاوت از یکدیگر، محقق ساخته است که در یازده سیستم حلال (فاز ثابت +فاز متحرک) تقریباً پاسخگوی شرایط پایین می باشند.

جدول 1 سیستمهای حلال مناسب برای کروماتوگرافی کاغذی

و از آن ها می توان برای جداسازی مخلوط های مختلف به وسیله کروماتوگرافی کاغذی به روش مستقیم استفاده کرد. لازم به تذکر است که خواص فیزیکی حلال ثابت( فاز ثابت )بر روی قطر لکه تاثیر تعیین کننده ای دارد . تجربه ثابت کرده است هر اندازه ویسکوزیته فاز ثابت کمتر باشد، به همان میزان انتشار آن بیشتر بوده و لکه‌های تولید خواهد شد و لکه های وابسته به عناصری که R_f آنها به هم نزدیک است همدیگر را خواهد پوشاند .

کاربرد کروماتوگرافی کاغذی

کروماتوگرافی کاغذی در آغاز برای جداسازی اسیدهای آمینه توسط محققین ابداع و توسعه یافت. ابتدا تصور می‌شد که کروماتوگرافی کاغذی تنها برای جداسازی مواد بیولوژیکی و مواد آلی قابل استفاده است؛ اما بعدها پژوهش‌های متعددی نشان داد که از آن می‌توان برای جداسازی اجسامی معدنی (کاتیون‌ها و آنیون‌ها) نیز استفاده کرد. میزان موفقیت در جداسازی اجسام معدنی به امکان دستکاری و تعدیل ثابت‌های تقسیم اجسام آزمایشی بین دو فاز مایع بستگی دارد.

مطالبی که در مبحث استخراج مایع-مایع، در جهت جداسازی انتخابی عناصر مطرح می‌شود، با اندک اختلافی درباره جداسازی به روش کروماتوگرافی کاغذی نیز صادق است. در استخراج مایع-مایع سعی می‌شود که ثابت توزیع جسم مورد استخراج را حتی‌المقدور افزایش دهند و ثابت توزیع جسم مزاحم (به منظور جلوگیری از استخراج آن) را کاهش دهند. در کروماتوگرافی کاغذی، باید شرایطی فراهم آورد که ضرایب تقسیم اجسام تشکیل‌دهنده مخلوط ارقامی در اطراف یک مقدار خاص را به خود بگیرند؛ زیرا بزرگ بودن ضریب تقسیم موجب می‌شود که نمونه آزمایشی همواره در فاز ثابت باقی بماند و در روی کروماتوگرام در جریان گسترش با فاز متحرک جابه‌جا نشود. به‌طرز مشابهی، کوچک بودن آن موجب حرکت کامل جسم و فاز متحرک تا جبهه حلال خواهد شد.

سایر کاربردها 

در تجزیه کیفی کاتیون‌ها و آنیون‌های معدنی به روش کروماتوگرافی، همانند روش‌های تجزیه نیمه‌میکرو، ابتدا آن‌ها را در گروه‌های مختلف طبقه‌بندی کرده و سپس به جداسازی آن‌ها به روش کروماتوگرافی کاغذی جهت تشخیص اقدام می‌کنند. به‌عنوان مثال، برای تفکیک کاتیون‌های گروه یک (Ag⁺، Hg₂²⁺، Pb²⁺)، از محلول متانولی اسید نیتریک به غلظت ۱۱ مول بر لیتر استفاده می‌شود که Rf آن‌ها با شیوه گسترش بالارونده به ترتیب برابر با ۰.۲۹، ۰.۳۹، ۰.۵۱ و ۰.۷۹ می‌باشد.

برای کاتیون‌های گروه دو، مقادیر Rf متناسب با حضور آنیون‌های مختلف در محلول متفاوت است. مثلاً مقادیر Rf با سیستم گسترش‌دهنده متیل n-پروپیل کتون که دارای ۱۵ درصد اسید کلریدریک ۱۰ نرمال است، برای سرب ۰.۱۹، بیسموت ۰.۴، مس ۰.۶، کادمیوم ۰.۷۵ و جیوه دو ظرفیتی ۰.۸ می‌باشد. در صورتی که کاتیون‌های گروه سوم با کاتیون‌های سبک واجد اسید کلریدریک برای جداسازی می‌باشند. به‌عنوان مثال، مقادیر Rf با استون واجد ۲۰ درصد اسید کلریدریک برای نیکل، منگنز و کبالت به ترتیب برابر ۰.۰۳، ۰.۲۶، ۰.۵۱ و ۰.۸۱ می‌باشد.

یون‌های گروه ۴ یا قلیایی خاکی را با استفاده از شیوه مدور و با استفاده از مخلوط اتانول-متانول و با نسبت‌های ۱-۱ جدا می‌کنند. در این شرایط، مقدار Rf برای باریم، استرانسیوم، کلسیم و منیزیم به ترتیب برابر با ۰.۲۸، ۰.۴۹، ۰.۶۲ و ۰.۸۰ به‌دست می‌آید. یون‌های قلیایی نیز با به‌کارگیری روش گسترش مدور و با استفاده از سیستم حلال بوتانول نرمال و متانول با نسبت‌های (۷:۳) با موفقیت جدا می‌شوند و مقدار Rf در مورد پتاسیم برابر با ۰.۳۱، سدیم ۰.۴۸ و NH₄⁺ و لیتیم به ترتیب برابر ۰.۵۷ و ۰.۷۸ می‌باشد.

به‌طرز مشابهی، مخلوط آنیون‌ها نیز به روش کروماتوگرافی قابل جداسازی و تشخیص است. سیستم گسترش‌دهنده در این مورد استون یا الکل‌ها همواره با یک باز نظیر آمونیاک یا پیریدین می‌باشد. مثلاً با استفاده از حلال اتانول-ایزوبوتانول-آمونیاک قادر است مخلوط‌های Na₂H₂PO₂، NaH₂PO₃، Na₂HPO₄ و Na₂H₂P₂O₆ را از یکدیگر جدا و آن‌ها را در کنار هم تشخیص دهد.

مقدار ترکیبات آلی که جداسازی آن‌ها به روش کروماتوگرافی تقسیمی روی کاغذ امکان‌پذیر است، بی‌نهایت زیاد و متنوع می‌باشد که برای رعایت اختصار تنها به ذکر چند مورد اکتفا می‌شود. مثلاً مخلوط قندها را با استفاده از شیوه مدور و حلال گسترش‌دهنده‌ای مانند بوتان + استون + آب می‌توان از یکدیگر جدا کرد و تشخیص داد.

به‌طرز مشابهی، مخلوط اسیدهای کربوکسیلیک با حداکثر ۸ کربن را می‌توان با استفاده از آمونیاک که ۰.۷۸ مول بر لیتر در بوتانول نرمال است (به‌استثنای اسید استیک و اسیدهای فرمیک) با موفقیت از یکدیگر جدا ساخت. بالاخره، جداسازی مخلوط آلکالوئیدها، ویتامین‌ها، آنتی‌بیوتیک‌ها، رنگ‌ها و رنگدانه‌ها و غیره به روش کروماتوگرافی کاغذی امکان‌پذیر است.