کروماتوگرافی کاغذی

شومبین در سال ۱۸۶۰ با عبور دادن مایعاتی از میان کاغذ مخصوص متوجه شد که حلال خالص در شیارهای کاغذ سریعتر از محلول ها حرکت می کند و نیز دریافت که برخی از اجسام تشکیل دهنده محلول ها نسبت به برخی دیگر سریعتر حرکت می کنند. از این پدیده استفاده کرده، روشی برای جداسازی رنگدانه‌های گیاهی _آلکالوئیدها، چربی‌ها، روغن‌ها و عصاره های مواد غذایی ابداع نمود. در این روش اساس تفکیک مبتنی بر جذب مواد موجود در محلول بر روی کاغذ، در جریان عبور از شیارهای آن می باشد که با اندازه گیری فاصله جبهه حلال (حلالی که مواد قبلا مورد در آن حل شده اند) فاصله اجسام جذب شده در روی کاغذ از مبدا حرکت، نوع ماده مجهول قابل تعیین است. بدیهی است که این روش با روش کروماتوگرافی کاغذی که امروز متداول است( گسترش کروماتوگرام به وسیله یک حلال) اختلاف اساسی دارد زیرا در روش شوبین حلالی به عنوان گسترش دهنده به کار نمی‌رود.

این شیوه از جداسازی تا سال ۱۹۴۳ پیشرفت چشمگیری نکرد تا اینکه در جریان سال‌های بعد از ۱۹۴۳ مارتن و همکاران وی با الهام از روش شونبین و تلفیق آن روش با روش استخراج با جریان مخالف، شیوه ای  به نام کروماتوگرافی کاغذی ابداع کردند. این محققین نشان دادند که اگر قطره کوچکی از ماده آزمایشی را بر روی کاغذ صافی ویژه ای قرار داده و آن را با حلال مناسب گسترش دهند،هر یک حرکت تشکیل دهنده های نمونه آزمایشی در فاصله معینی از مبدا حرکت بر روی کاغذ قرار می گیرد. اگرچه خاصیت جذب سطحی و مبادله یون در تمام کاغذهای مورد استفاده از کروماتوگرافی کاغذی، کم و بیش وجود دارد، با این حال مهاجرت افتراقی اجسام به هنگام گسترش کروماتوگرام از اختلاف ضریب تقسیم آنها بین دو فاز ثابت و متحرک مایع سرچشمه می‌گیرد. لازم به یادآوری است که گاهی از کاغذهای ویژه‌ای که به آنها آلومینا تزریق شده و یا از مبادله کننده های یون پوشیده شده‌اند برای جریان کروماتوگرافی کاغذی تحت حاکمیت پدیده جذب سطحی و یا مبادله‌ای استفاده می گردد .

اساس جدا تجزیه کیفی با کروماتوگرافی کاغذی همانند روش شومین بر پایه اندازه گیری جبهه حلال و فاصله جسم در روی کاغذ از مبدا حرکت و تعیین نسبت این دو( R_f)  استوار است.

تجزیه کمی به کمک کروماتوگرافی کاغذی بسیار ظریف بوده و این عمل را می توان با اندازه گیری مساحت لکه حاصل در روی کروماتوگرام و با استفاده از منحنی معیارگیری انجام داد و یا لکه ایجاد شده را با شستشو از کاغذ خارج و به کمک روش های حساس، نظیر تجزیه به روش فعال ساختن اندازه گرفت.

• اصول نظری

فاکتور تاخیر ( R_f)  که ارزش آن برای هر جسم در دمای ثابت تقریباً ثابت می باشد، مشخص جسم آزمایشی است، زیرا مطابق رابطه زیر، ( R_f) از ضریب تقسیم جسم بین دو فاز مایع به کار رفته در کروماتوگرافی تبعیت می‌کند:

در کروماتوگرافی کاغذی که بستر جدا کننده را می‌توان دو بعدی در نظر گرفت، V_mو V_s مفهومی نداشته  R_f بر حسب مقاطع عرضی فازهای ثابت، A_s و متحرک، A_m،  مطابق رابطه بالا قابل نمایش است:

رابطه بالا نشان می‌دهد که هر اندازه مقدار P_A بزرگتر باشد به همان میزان ارزش R_f کوچک تر خواهد بود .یعنی از جسم آزمایشی تمایل به ترک فاز ثابت و حرکت و با فاز متحرک را نخواهد داشت، عبارت دیگر زمان لازم برای دور شدن جسم آزمایشی از مبدا حرکت طولانی‌تر خواهد بود و برعکس.

نظر به اینکه مقدار R_f  در شرایط استاندارد برای هر جسم مقدار ثابتی است، از این رو می‌توان با اندازه گیری R_f یک جسم مجهول، نسبت به تشخیص تقریبی و مقدماتی آن اقدام کرد. همچنین با اندازه گیری R_f اجسام مختلف به طور جداگانه و یا در کنار هم در شرایط یکسان می‌توان امکان شناسایی برخی از آنها را در حضور برخی دیگر پیش‌بینی کرد. برای تشخیص اجسام تشکیل دهنده یک مخلوط لازم است پیشاپیش اطلاع کلی و عمومی از تشکیل دهنده های آن را در دست داشت و آنگاه به کروماتوگرافی آن در کنار نمونه های خالص از تشکیل دهنده های مخلوط (به عنوان شاهد ) اقدام کرد. لازم به ذکر است که ترکیبات مختلف اغلب دارای R_f نزدیک به هم بوده و این امر مسئله تشخیص دهنده های یک نمونه مجهول را مشکل و پیچیده می سازد .می توان نتیجه گرفت که R_f یک کمیت نسبی و مقایسه‌ای است و به دلیل تغییر آن با شرایط تجربی، کاربرد مطلق آن از اهمیت کمتری برخوردار بوده و در برخی موارد فاقد ارزش عملی است.

• عوامل وابسته به نمونه آزمایشی:

اجسام مختلف موجود در یک نمونه آزمایشی بر مقدار R_f هم دیگر اثر می گذارند. بدین بیان که مقدار R_f به دست آمده در کروماتوگرافی انفرادی هر یک از تشکیل دهنده های فاز، با R_f آنها در حضور یکدیگر متفاوت است. این امر به تاثیر متقابل و گاهی به تاثیر شیمیایی تشکیل دهنده های مخلوط آزمایشی بر یکدیگر مرتبط می شود. حتی در برخی موارد وجود چند جسم  در محلول آزمایشی منجر به تشکیل ترکیبی تازه با R_f جدید می‌شود. مثلاً وجود الکل در نمونه‌ای از اسید آمینه به وجود آمدن استر با R_f  کاملاً متفاوت می گردد. از سوی دیگر غلظت اجسام در نمونه آزمایشی بر روی ضریب تقسیم آن موثر بوده و از این راه بر R_f نیز تاثیر می گذارد.

• اصول عملی

چهارم مطلب مهم موضوع بحث این قسمت را تشکیل می‌دهند که در زیر به توضیح و بررسی مختصر هریک از آنها می پردازیم:

• انتخاب فاز متحرک

یک فاز متحرک مناسب برای کروماتوگرافی کاغذی باید مطیع نتایج زیر را به دست دهد:

– مقدار R_f برای هر یک از تشکیل دهنده های نمونه های آزمایشی بین 0.05 و 0.85 قرار می‌گیرد.

-اختلاف بین مقادیر R_f دو جسم مورد جداسازی باید حداقل 0.05 باشد.

– ضریب تقسیم اجسام تشکیل دهنده مخلوط بین فاز ثابت و متحرک باید مستقل از غلظت آنها باشد (ایزوترم خطی) تا یک لکه کروی کروماتوگرام حاصل شود .

-حلال نباید با هیچ یک از تشکیل دهنده های مخلوط آزمایشی به طور شیمیایی وارد عمل شود.

– حلال به هنگام آشکارسازی کروماتوگرام ایجاد مزاحمت نکنم (مزاح آشکارسازی نگردد).

– نسبت ترکیبی حلال نباید در جریان آزمایشی تغییر کند .

بررسی نمونه‌های متنوع و کاملا متفاوت از یکدیگر، محقق ساخته است که در یازده سیستم حلال(فاز ثابت +فاز متحرک) تقریباً پاسخگوی شرایط پایین می باشند

جدول 1سیستمهای حلال توصیه شده برای کروماتوگرافی کاغذی

و از آن ها می توان برای جداسازی مخلوط های مختلف به وسیله کروماتوگرافی کاغذی به روش مستقیم استفاده کرد. لازم به تذکر است که خواص فیزیکی حلال ثابت( فاز ثابت )بر روی قطر لکه تاثیر تعیین کننده ای دارد . تجربه ثابت کرده است هر اندازه ویسکوزیته فاز ثابت کمتر باشد، به همان میزان انتشار آن بیشتر بوده و لکه‌های تولید خواهد شد و لکه های وابسته به عناصری که R_f آنها به هم نزدیک است همدیگر را خواهد پوشاند .

• کاربرد کروماتوگرافی کاغذی

کروماتوگرافی کاغذی در آغاز برای جداسازی اسیدهای آمینه توسط محققین ابداع و توسعه یافت. ابتدا تصور می رفت که کروماتوگرافی کاغذی، تنها برای جداسازی مواد بیولوژیکی و مواد آلی قابل بکارگیری است در صورتی که بعدها ،پژوهش‌های متعددی نشان داد که از آن می توان برای جداسازی اجسامی معدنی (کاتیونها و آنیون ها ) نیز استفاده کرد. میزان موفقیت در جداسازی اجسام معدنی به امکان دستکاری و تعدیل ثابت های تقسیم اجسام آزمایشی بین دو فاز مایع بستگی دارد. مطالبی که در مبحث استخراج مایع-مایع، در جهت جداسازی انتخابی عناصر آمده است، با اندک اختلافی درباره جداسازی به روش کروماتوگرافی کاغذی نیز صادق است. بدین بیان که در استخراج مایع-مایع سعی می‌کنند که ثابت توزیع جسم مورد استخراج را حتی الامکان افزایش داده و ثابت توزیع جسم مزاحم( به منظور جلوگیری از استخراج آن) را از یک تقلیل دهند .در صورتی که در کروماتوگرافی کاغذی شرایطی را باید فراهم آورد که ضرایب تقسیم اجسام تشکیل دهنده مخلوط ارقامی در اطراف یک را به خود بگیرند، زیرا بزرگ بودن ضریب تقسیم موجب می شود که نمونه آزمایشی همواره در فاز ثابت باقی مانده و در روی کروماتوگرام در جریان گسترش با فاز متحرک جابه جا نشود و به طرز مشابهی کوچک بودن آن موجب حرکت کامل جسم و فاز متحرک تا جبهه حلال خواهد شد .

در تجزیه کیفی کاتیون ها و آنیون های معدنی به روش کروماتوگرافی، همانند روش های تجزیه نیمه میکرو، ابتدا آنها را در گروه های مختلف طبقه بندی کرده و سپس به جداسازی آنها به روش کروماتوگرافی کاغذی جهت تشخیص اقدامی نمی اقدام می نمایند. مثلاً برای تفکیک کاتیون های گروه یک(Ag⁺ ، Hg₂ ⁺⁺ ،Pb⁺⁺) ، از محلول متانولی اسید نیتریک به غلظت 11 مولبر لیتر استفاده می‌کنند که R_f آنها با شیوه گسترش بالارونده به ترتیب برابر با ۲۹/0 ، 39/0 ، 0.51و 79.0 می باشد .

برای کاتیون های گروه دو مقادیر R_f متناسب با حضور انیون های مختلف در محلول متفاوت است. مثلاً مقادیر R_f با سیستم گسترش دهنده متیل n-پروپیل کتون که دارای ۱۵ درصد اسید کلریدریک ۱۰ نرمال است، برای سرب0.19 ، بیسموت0.4 ، مس 0.6، کادمیوم ۷۵/0 و جیوه دو ظرفیتی 0.8می باشند. در صورتی که کاتیون های گروه سوم با کاتیون های سبک واجد اسید کلریدریک برای جداسازی می باشند. به عنوان مثال مقادیر R_f با استون واجد ۲۰ درصد اسید کلریدریک و  برای نیکل، منگنز و کبالت و به ترتیب برابر0.03، 0.26، 0.51، 0.81می باشد. یون های گروه ۴ یا قلیایی خاکی را با به کار گرفتن شیوه مدور و و با استفاده از مخلوط اتانول -متانول و با نسبتهای 1 – 1 عنوان فاز متحرک جدا نموده اند. در این شرایط مقدار R_f برای باریم،  استرانسیوم کلسیم و منیزیم به ترتیب برابر با 0.28، 0.49، 0.62، 0.80 به دست آمده است .یون های قلیایی نیز با به کارگیری شیوه گسترش مدور و با استفاده از سیستم حلال بوتانول نرمال و متانول با نسبتهای ( ۷:3 )با موفقیت جدا شده اند و مقدار R_f در مورد پتاسیم برابر با ۳۱ /0، سدیم ۴۸/0 و NH₄⁺ ,و لیتیم به ترتیب برابر ۵۷/0 و ۷۸/0 می‌باشد. به طرز مشابهی مخلوط انیون ها  نیز به روش کروماتوگرافی قابل جداسازی و تشخیص می باشد. سیستم گسترش دهنده در این مورد استون یا الکل ها همواره با یک باز نظیر آمونیاک را پیریدین می باشد. مثلا با به کار بستن حلال اتانول -ایزوبوتانول -آمونیاک توانسته اند مخلوط های Na₂H₂PO₂، NaH₂PO₃،  Na₂HPO₄و Na₂H₂P₂O₆ را از یکدیگر جدا و آنها را در کنار هم تشخیص دهند. مقدار ترکیبات آلی که جداسازی آنها به روش کروماتوگرافی تقسیمی روی کاغذ امکان پذیر است بی نهایت زیاد و متنوع می باشد که برای رعایت اختصار تنها به به ذکر چند مورد اکتفا می گردد .مثلا مخلوط قند ها را با به کار بستن شیوه مدور و حلال گسترش دهنده ان بوتان+ استون + اب  می توان از یکدیگر جدا ساز ساخته و تشخیص داد. به طرز مشابهی مخلوط اسیدهای کربوکسیلیک باحداکثر ۸ کربن را می‌توان با استفاده از آمونیاک که ۷۸/0 مول بر لیتر در بوتانول نرمال( به ا استثنایی اسید استیک و اسید های فرمیک) با موفقیت از یکدیگر جدا ساخت. بالاخره جدا سازی مخلوط آلکوئید ها، ویتامین ها، آنتی بیوتیک ها، رنگ ها و رنگدانه های رنگدانه ها و غیره به روش کروماتوگرافی کاغذی امکان‌پذیراست.